Extracellular Redox State Regulates Expression of Vascular NADPH Oxidases

Abstract

<p style="text-align: justify; "> Do nedavno se smatralo da redoks regulacija signalnih puteva u ćelijama&nbsp;podrazumeva isključivo direktan uticaj reaktivnih kiseoničnih radikala na brojne molekule&nbsp;i procese u ćeliji, međutim, danas se zna da promene redoks stanja (Eh) tiol-disulfidnih&nbsp;parova imaju takođe značajnu ulogu. Reverzibilne reakciije tiol-disulfidnih parova su od&nbsp;izuzetnog značaja za nesmetano odvijanje brojnih ćelijskih procesa, kao &scaron;to su enzimska&nbsp;kataliza, ćelijski signaling, proliferacija, diferencijacija i apoptoza, a pokazano je i da&nbsp;imaju ulogu u patogenezi brojnih bolesti. Većina istraživanja o tiol-dislufidnim parovima i&nbsp;oksidativnom stresu su poslednjih decenija bila usmerena uglavnom na glutation i njegov&nbsp;disulfid (GSH/GSSG), koji zajedno predstavljaju najznačajniji intracelularni redoks par,&nbsp;međutim, nedavno je uočeno da je i ekstracelularna tiol-disulfidna sredina koja se sastoji&nbsp;prevashodno od cisteina (CyS)/cistina (CyS) takođe veoma značajna. CyS/CySS je&nbsp;najzastupljeniji redoks par u plazmi i drugim vanćelijskim tečnostima. Istraživanja na&nbsp;određenom uzorku ljudske populacije su pokazala da je vi&scaron;e oksidovano redoks stanje&nbsp;plazme u korelaciji sa brojnim faktorima rizika za kardiovaskularne bolesti, kao &scaron;to su&nbsp;pu&scaron;enje, tip 2 dijabetes, konzumiranje alkohola i starenje. Međutim, ćelijski mehanizmi&nbsp;preko kojih ekstracelularno redoks stanje može da dovede do bolesti nisu poznati.&nbsp;U ovom radu je ispitivan efekat ekstracelularnog redoks stanja (Eh) na ekspresiju&nbsp;NADPH oksidaza u vaskularnim ćelijama. Intaktni segmenti mi&scaron;ijih aorti i glatkomi&scaron;ićne&nbsp;ćelije aorte u kulturi (VSMCs) su izloženi ekstracelularnim redoks stanjima između -150&nbsp;mV (redukovano Eh) i 0 mV (okidovano Eh) tako &scaron;to su menjane koncentracije CyS i&nbsp;njegovog disulfida CySS. Rezultati istraživanja su pokazali da vi&scaron;e oksidovano Eh&nbsp;Cys/CySS stimuli&scaron;e ekspresiju gena za Nox1 u VSMCs, ali ne i Nox4. Povećana ekspresija&nbsp;Nox1 je pokazana i na nivou proteina kori&scaron;ćenjem Western blot metode. Kori&scaron;ćenjem&nbsp;fluorescentne metode sa dihidroetidijumom utvrđeno je da oksidovano Eh Cys/CySS&nbsp;povećava Nox1-zavisnu produkciju superoksida u VSMCs. Obzirom da je pokazano da&nbsp;superoksid poreklom od Nox1 ima ulogu u regulaciji ćelijskog rasta, ispitan je efekat&nbsp;ekstracelularnog Eh Cys/CySS na proliferaciju VSMCs. U poređenju sa redukovanim&nbsp;uslovima, oksidovano Eh je dovelo do povećanja ukupnog broja ćelija za 1.3 puta i&nbsp;inkorporacije [3H] timidina za 1.6 puta, pri čemu je utvrđeno da ovaj proces direktno zavisi&nbsp;od ekspresije Nox1. Ispitivanjem signalnih puteva koji učestvuju u ekspresiji gena za Nox1&nbsp;utvrđeno je da oksidovano Eh Cys/CySS dovodi do brze fosforilacije receptora za&nbsp;epidermalni faktor rasta (EGFR) u VSMCs. Ovaj efekat je u značajnoj meri umanjen&nbsp;delovanjem inhibitora metaloproteinaza GM6001, &scaron;to ukazuje da se epidermalnom faktoru&nbsp;rasta slični ligandi oslobađaju sa povr&scaron;ine ćelije. Rezultati detaljnog ispitivanja uloge&nbsp;metaloproteinaza su pokazali da izlaganje VSMCs oksidovanom Eh Cys/CySS aktivira&nbsp;matriks metaloproteinaze (MMP) kao i familiju disintegrin i metaloproteinaza (ADAM).&nbsp;Pored toga, izlaganje ćelija oksidovanom Eh dovodi do fosforilacije ekstracelularnim&nbsp;signalom regulisane kinaze 1/2 (ERK1/2) i fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K/Akt).&nbsp;Fosforilacija ERK1/2 i PI3K/Akt je u značajnoj meri umanjena delovanjem GM6001 i&nbsp;specifičnog inhibitora EGFR fosforilacije AG1478. GM6001 i AG1478 takođe sprečavaju&nbsp;porast ekspresije gena za Nox1 izazvan oksidovanim Eh Cys/CySS. Dalje je utvrđeno da&nbsp;specifičan inhibitor ERK1/2 fosforilacije U0126 sprečava Nox1 promotor-zavisnu&nbsp;luciferaznu aktivnost, dok inhibicija PI3K/Akt signalnog puta kori&scaron;ćenjem vortmanina&nbsp;nema isti efekat. Ispitujući signalne mehanizme u jedru, utvrđeno je da oksidovano Eh&nbsp;Cys/CySS dovodi do ERK1/2-zavisne fosforilacije transkripcionih faktora aktivirajući&nbsp;transkripcioni faktor-1 (ATF-1) i protein koji vezuje cAMP zavisni element (CREB),<br /> međutim, samo ATF-1 ima ulogu u ekspresiji gena za Nox1 u uslovima ekstracelularnog&nbsp;oksidativnog stresa, &scaron;to je potvrđeno kori&scaron;ćenjem siRNK. Dodatni eksperimenti su&nbsp;pokazali da oksidovano Eh Cys/CySS dovodi do fosforilacije protein kinaze A (PKA), kao i&nbsp;da PKA inhibitor H-89 sprečava fosforilaciju ATF-1 i CREB. Međutim, inhibicija PKA&nbsp;kori&scaron;ćenjem H-89 ne sprečava porast Nox1 promotor-zavisne luciferazne aktivnosti&nbsp;izazvan oksidovanim ekstracelularnim Eh Cys/CySS.&nbsp;Na kraju, op&scaron;ti zaključak je da prikazani rezultati identifikuju signalni put u&nbsp;VSMCs gde oksidacija esktracelularnog okruženja aktivira EGFR putem aktivacije&nbsp;metaloproteinaza i oslobađanja liganada sa povr&scaron;ine ćelije, &scaron;to zatim dovodi do ERK1/2-&nbsp;zavisne aktivacije transkripcionog faktora ATF-1 i ekspresije gena za Nox1. Ova zapažanja&nbsp;opisuju novi mehanizam putem kojeg ekstracelularni oksidativni stress (nastao&nbsp;oksidacijom Cys/CySS redoks para) aktivira redoks-zavisne signalne puteve koji zatim&nbsp;stimuli&scaron;u ekspresiju NADPH okidaza i proliferaciju ćelija u vaskularnim bolestima.</p>

<p> Generation of reactive oxygen species (ROS) by Nox-based NADPH oxidases<br /> activate redox-dependent signaling pathways and contribute to development of oxidative<br /> stress in vascular disease. Redox-sensitive cell signaling pathways are susceptible not only<br /> to ROS but also to the redox state of thiol/disulfide couples. A more oxidized plasma redox<br /> state has been correlated with increasing number of cardiovascular risk factors. However,<br /> cellular mechanisms by which extracellular redox state may cause disease are not known.<br /> In this study, we examined the effect of extracellular redox state (Eh) on expression of<br /> NADPH oxidases in vascular cells. Intact murine aortic segments and cultured aortic<br /> smooth muscle cells (VSMCs) were exposed to extracellular redox states between -150<br /> mV (reduced) and 0 mV (oxidized) by altering the concentration of cysteine (CyS) and its<br /> disulfide cystine (CySS), the predominant redox couple (Cys/CySS) in plasma. A more<br /> oxidized Eh Cys/CySS increased expression of Nox1, but not Nox4, and resulted in Nox1-<br /> dependent proliferation of VSMCs. Oxidized Eh Cys/CySS rapidly induced epidermal<br /> growth factor receptor (EGFR) phosphorylation in VSMCs, which was attenuated by the<br /> metalloproteinase inhibitor GM6001, suggesting shedding of EGF-like ligands from the<br /> cell surface. In addition, exposure to an oxidized Eh resulted in phosphorylation of<br /> extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt<br /> (PI3K/Akt), which was prevented by GM6001 and by AG1478, an inhibitor of EGFR<br /> phosphorylation. Both GM6001 and AG1478 also prevented the oxidized Eh-induced<br /> increase in Nox1 expression. In addition, oxidized Eh Cys/CySS caused ERK1/2-<br /> dependent phosphorylation of the transcription factors activating transcription factor-1<br /> (ATF-1) and cAMP-response-element-binding protein (CREB). Inhibition of ERK1/2<br /> activation, or siRNA to ATF-1, prevented the increase in Nox1 expression. Additional<br /> experiments showed that oxidized Eh Cys/CySS caused phosphorylation of protein kinase<br /> A (PKA) and of two transcription factors, ATF-1 and CREB. Inhibition of EGFR<br /> phosphorylation by AG1478 blocked ATF-1 but not CREB phosphorylation, whereas the<br /> potent PKA inhibitor H-89 suppressed both CREB and ATF-1 phosphorylation.<br /> In summary, our findings identify a signaling pathway in VSMCs whereby<br /> oxidation of the extracellular environment activates EGFR through metalloproteinasemediated<br /> shedding of EGF-like ligands, leading to ERK1/2-dependent activation of the<br /> transcription factor ATF-1 and subsequent expression of Nox1. These findings establish a<br /> novel mechanism whereby extracellular oxidative stress, through oxidation of the<br /> Cys/CySS couple, activates redox-sensitive pathways that stimulate NADPH oxidase<br /> expression and VSMC proliferation in vascular disease.</p>