Please use this identifier to cite or link to this item:
https://open.uns.ac.rs/handle/123456789/27668
Title: | Extracellular Redox State Regulates Expression of Vascular NADPH Oxidases Ekstracelularno redoks stanje u regulaciji ekspresije vaskularnih NADPH oksidaza |
Authors: | Stanić Bojana | Keywords: | ateroskleroza, NADPH oksidaze, oksidativni stres, ekstracelularno redoks stanje | Publisher: | Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematički fakultet u Novom Sadu University of Novi Sad, Faculty of Sciences at Novi Sad |
Abstract: | <p style="text-align: justify; "> Do nedavno se smatralo da redoks regulacija signalnih puteva u ćelijama podrazumeva isključivo direktan uticaj reaktivnih kiseoničnih radikala na brojne molekule i procese u ćeliji, međutim, danas se zna da promene redoks stanja (Eh) tiol-disulfidnih parova imaju takođe značajnu ulogu. Reverzibilne reakciije tiol-disulfidnih parova su od izuzetnog značaja za nesmetano odvijanje brojnih ćelijskih procesa, kao što su enzimska kataliza, ćelijski signaling, proliferacija, diferencijacija i apoptoza, a pokazano je i da imaju ulogu u patogenezi brojnih bolesti. Većina istraživanja o tiol-dislufidnim parovima i oksidativnom stresu su poslednjih decenija bila usmerena uglavnom na glutation i njegov disulfid (GSH/GSSG), koji zajedno predstavljaju najznačajniji intracelularni redoks par, međutim, nedavno je uočeno da je i ekstracelularna tiol-disulfidna sredina koja se sastoji prevashodno od cisteina (CyS)/cistina (CyS) takođe veoma značajna. CyS/CySS je najzastupljeniji redoks par u plazmi i drugim vanćelijskim tečnostima. Istraživanja na određenom uzorku ljudske populacije su pokazala da je više oksidovano redoks stanje plazme u korelaciji sa brojnim faktorima rizika za kardiovaskularne bolesti, kao što su pušenje, tip 2 dijabetes, konzumiranje alkohola i starenje. Međutim, ćelijski mehanizmi preko kojih ekstracelularno redoks stanje može da dovede do bolesti nisu poznati. U ovom radu je ispitivan efekat ekstracelularnog redoks stanja (Eh) na ekspresiju NADPH oksidaza u vaskularnim ćelijama. Intaktni segmenti mišijih aorti i glatkomišićne ćelije aorte u kulturi (VSMCs) su izloženi ekstracelularnim redoks stanjima između -150 mV (redukovano Eh) i 0 mV (okidovano Eh) tako što su menjane koncentracije CyS i njegovog disulfida CySS. Rezultati istraživanja su pokazali da više oksidovano Eh Cys/CySS stimuliše ekspresiju gena za Nox1 u VSMCs, ali ne i Nox4. Povećana ekspresija Nox1 je pokazana i na nivou proteina korišćenjem Western blot metode. Korišćenjem fluorescentne metode sa dihidroetidijumom utvrđeno je da oksidovano Eh Cys/CySS povećava Nox1-zavisnu produkciju superoksida u VSMCs. Obzirom da je pokazano da superoksid poreklom od Nox1 ima ulogu u regulaciji ćelijskog rasta, ispitan je efekat ekstracelularnog Eh Cys/CySS na proliferaciju VSMCs. U poređenju sa redukovanim uslovima, oksidovano Eh je dovelo do povećanja ukupnog broja ćelija za 1.3 puta i inkorporacije [3H] timidina za 1.6 puta, pri čemu je utvrđeno da ovaj proces direktno zavisi od ekspresije Nox1. Ispitivanjem signalnih puteva koji učestvuju u ekspresiji gena za Nox1 utvrđeno je da oksidovano Eh Cys/CySS dovodi do brze fosforilacije receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR) u VSMCs. Ovaj efekat je u značajnoj meri umanjen delovanjem inhibitora metaloproteinaza GM6001, što ukazuje da se epidermalnom faktoru rasta slični ligandi oslobađaju sa površine ćelije. Rezultati detaljnog ispitivanja uloge metaloproteinaza su pokazali da izlaganje VSMCs oksidovanom Eh Cys/CySS aktivira matriks metaloproteinaze (MMP) kao i familiju disintegrin i metaloproteinaza (ADAM). Pored toga, izlaganje ćelija oksidovanom Eh dovodi do fosforilacije ekstracelularnim signalom regulisane kinaze 1/2 (ERK1/2) i fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K/Akt). Fosforilacija ERK1/2 i PI3K/Akt je u značajnoj meri umanjena delovanjem GM6001 i specifičnog inhibitora EGFR fosforilacije AG1478. GM6001 i AG1478 takođe sprečavaju porast ekspresije gena za Nox1 izazvan oksidovanim Eh Cys/CySS. Dalje je utvrđeno da specifičan inhibitor ERK1/2 fosforilacije U0126 sprečava Nox1 promotor-zavisnu luciferaznu aktivnost, dok inhibicija PI3K/Akt signalnog puta korišćenjem vortmanina nema isti efekat. Ispitujući signalne mehanizme u jedru, utvrđeno je da oksidovano Eh Cys/CySS dovodi do ERK1/2-zavisne fosforilacije transkripcionih faktora aktivirajući transkripcioni faktor-1 (ATF-1) i protein koji vezuje cAMP zavisni element (CREB),<br /> međutim, samo ATF-1 ima ulogu u ekspresiji gena za Nox1 u uslovima ekstracelularnog oksidativnog stresa, što je potvrđeno korišćenjem siRNK. Dodatni eksperimenti su pokazali da oksidovano Eh Cys/CySS dovodi do fosforilacije protein kinaze A (PKA), kao i da PKA inhibitor H-89 sprečava fosforilaciju ATF-1 i CREB. Međutim, inhibicija PKA korišćenjem H-89 ne sprečava porast Nox1 promotor-zavisne luciferazne aktivnosti izazvan oksidovanim ekstracelularnim Eh Cys/CySS. Na kraju, opšti zaključak je da prikazani rezultati identifikuju signalni put u VSMCs gde oksidacija esktracelularnog okruženja aktivira EGFR putem aktivacije metaloproteinaza i oslobađanja liganada sa površine ćelije, što zatim dovodi do ERK1/2- zavisne aktivacije transkripcionog faktora ATF-1 i ekspresije gena za Nox1. Ova zapažanja opisuju novi mehanizam putem kojeg ekstracelularni oksidativni stress (nastao oksidacijom Cys/CySS redoks para) aktivira redoks-zavisne signalne puteve koji zatim stimulišu ekspresiju NADPH okidaza i proliferaciju ćelija u vaskularnim bolestima.</p> <p> Generation of reactive oxygen species (ROS) by Nox-based NADPH oxidases<br /> activate redox-dependent signaling pathways and contribute to development of oxidative<br /> stress in vascular disease. Redox-sensitive cell signaling pathways are susceptible not only<br /> to ROS but also to the redox state of thiol/disulfide couples. A more oxidized plasma redox<br /> state has been correlated with increasing number of cardiovascular risk factors. However,<br /> cellular mechanisms by which extracellular redox state may cause disease are not known.<br /> In this study, we examined the effect of extracellular redox state (Eh) on expression of<br /> NADPH oxidases in vascular cells. Intact murine aortic segments and cultured aortic<br /> smooth muscle cells (VSMCs) were exposed to extracellular redox states between -150<br /> mV (reduced) and 0 mV (oxidized) by altering the concentration of cysteine (CyS) and its<br /> disulfide cystine (CySS), the predominant redox couple (Cys/CySS) in plasma. A more<br /> oxidized Eh Cys/CySS increased expression of Nox1, but not Nox4, and resulted in Nox1-<br /> dependent proliferation of VSMCs. Oxidized Eh Cys/CySS rapidly induced epidermal<br /> growth factor receptor (EGFR) phosphorylation in VSMCs, which was attenuated by the<br /> metalloproteinase inhibitor GM6001, suggesting shedding of EGF-like ligands from the<br /> cell surface. In addition, exposure to an oxidized Eh resulted in phosphorylation of<br /> extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt<br /> (PI3K/Akt), which was prevented by GM6001 and by AG1478, an inhibitor of EGFR<br /> phosphorylation. Both GM6001 and AG1478 also prevented the oxidized Eh-induced<br /> increase in Nox1 expression. In addition, oxidized Eh Cys/CySS caused ERK1/2-<br /> dependent phosphorylation of the transcription factors activating transcription factor-1<br /> (ATF-1) and cAMP-response-element-binding protein (CREB). Inhibition of ERK1/2<br /> activation, or siRNA to ATF-1, prevented the increase in Nox1 expression. Additional<br /> experiments showed that oxidized Eh Cys/CySS caused phosphorylation of protein kinase<br /> A (PKA) and of two transcription factors, ATF-1 and CREB. Inhibition of EGFR<br /> phosphorylation by AG1478 blocked ATF-1 but not CREB phosphorylation, whereas the<br /> potent PKA inhibitor H-89 suppressed both CREB and ATF-1 phosphorylation.<br /> In summary, our findings identify a signaling pathway in VSMCs whereby<br /> oxidation of the extracellular environment activates EGFR through metalloproteinasemediated<br /> shedding of EGF-like ligands, leading to ERK1/2-dependent activation of the<br /> transcription factor ATF-1 and subsequent expression of Nox1. These findings establish a<br /> novel mechanism whereby extracellular oxidative stress, through oxidation of the<br /> Cys/CySS couple, activates redox-sensitive pathways that stimulate NADPH oxidase<br /> expression and VSMC proliferation in vascular disease.</p> |
URI: | https://open.uns.ac.rs/handle/123456789/27668 |
Appears in Collections: | PMF Teze/Theses |
Show full item record
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.