Prediction of trodimensional structure and characterisation of active sites of selected beta-galaktosidases

Abstract

<p>Proteini imaju osnovnu ulogu u&nbsp; životnim&nbsp;procesima, usled čega je isptivanje raznovrsnosti&nbsp;njihove strukture jedna od ključnih potreba&nbsp;modernih biolo&scaron;kih istraživanja. Cilj ove&nbsp;doktorske disertacije je predviđanje&nbsp;trodimenzionalne strukture beta-galaktozidaza&nbsp;odabranih bakterijskih sojeva (<em>Streptococcus&nbsp;thermophillus,&nbsp; Lactobacillus acidophilus</em>,&nbsp; i&nbsp;<em>Bifidobacterium animalis</em>&nbsp; ssp.&nbsp; <em>lactis</em>) kao i&nbsp;karakterizacija &nbsp;njihovih aktivnih mesta i&nbsp;određivanje aktivnih rezdua. Takođe, cilj&nbsp;disertacije obuhvata i ispitivanje beta-galaktozidaze&nbsp;<em> Bacteroides thetaiotaomicron</em>-a,&nbsp;kao i ispitivanje aktivnosti beta-galaktozidaze&nbsp;Kluyveromyces lactis-a. Na osnovu sličnosti&nbsp;<br />analizirane sekvence se mogu podeliti u dva&nbsp;klastera. Članovi klastera 1 pripadaju GH-2&nbsp;subfamiliji, dok članovi klastera 2 pripadaju GH-42 subfamiliji. Na osnovu klaster analize i poravnanja sekvenci&nbsp; predložene su&nbsp; katalitički&nbsp;aktivne rezidue beta-galaktozidaza ispitivanih&nbsp;sojeva: GLU458/GLU546 kod <em>S. thermophillus</em>-a,&nbsp;GLU148/GLU307 kod&nbsp;<em> L. Acidophilus-</em>a i&nbsp;GLU164/GLU324 kod<em> B. animalis</em> ssp.<em> lactis</em>-a.&nbsp;Konstruisani su homologi modeli beta-galaktozidaza<em> S. thermophilus, L. &nbsp;acidophilus, B.&nbsp;&nbsp; animalis</em>&nbsp; ssp.&nbsp;<em> lactis</em>.&nbsp; Iz rezultata simulacije&nbsp;molekularnog dokinga svih beta-galaktozidaza&nbsp;uočljivo je da se supstrat veže za aktivno mesto&nbsp;koje se nalazi u regionu visoke&nbsp;elektronegativnosti. Simulacije dokinga su&nbsp;potvrdile aktivna mesta predložena poravnanjem&nbsp;sekvenci i otkrile rezidue koje učestvuju u&nbsp;vezivanju laktoze i galaktoze kao supstrata.&nbsp;Obzirom da je objavljena samo jedna kristalna&nbsp;struktura beta-galaktozidaze sa laktozom u&nbsp;aktivnom mestu, analiza molekularnog dokinga&nbsp;laktoze kao supstrata je sprovedena i sa beta-alaktozidazama koje imaju određenu&nbsp;trodimenzionalnu strukturu. Na osnovu slučnosti&nbsp;sekvenci može se zaključiti da je nukleofilna&nbsp;rezidua beta-galaktozidaze <em>B. thetaiotaomicron</em>-a&nbsp;GLU259. Analizom konzervativnih regiona, kao i&nbsp;doking simulacije, može se zaključiti da ulogu&nbsp;proton donora ima rezidua GLU182. Hemijski&nbsp;sastav mleka za ispitivanje aktivnosti beta-galaktozidaze <em>Kluyveromyces lactis-</em>a je u skladu sa pravilnikom o kvalitetu proizvoda od mleka i&nbsp;starter kultura&nbsp; koji izdaje Ministarstvo&nbsp;<br />poljoprivrede i za&scaron;tite životne sredine Republike&nbsp;Srbije.&nbsp; Celokupna laktoza se razgradila u&nbsp;permeatu na temperaturi od 40&deg;C i pri&nbsp;koncentraciji enzima od 0,1% nakon 60 minuta od&nbsp;trenutka dodatka enzima. Maksimalna brzina&nbsp;postiže se toku prvih 10 minuta. Iz dobijenih&nbsp;rezultata može se zaključiti da beta-galaktozidaza&nbsp;<br /><em>K. lactis</em>-a ima visoku efikasnost prilikom&nbsp;razgradnje laktoze &scaron;to je čini pogodnom za&nbsp;<br />komercijalnu upotrebu u industriji mleka. U ovoj&nbsp;disertaciji predstavljen je protokol za&nbsp;<br />modelovanje komercijalno važnih beta-galaktozidaza i analiziranje njihovih &nbsp;interakcija sa laktozom kao supstratom. Dobijeni rezultati treba&nbsp;da pruže okvir za molekularna istraživanja&nbsp;vezivanja i razgradnje laktoze, kao i za buduće&nbsp;<br />dizajniranje komercijalno interesantnih beta-galaktzidaza.&nbsp;</p>

<p>Proteins have an essential role in all life&nbsp;processes. Therefore, investigation of their&nbsp;<br />structure diversity is one of the key focuses of&nbsp;modern biological researches. The aim of this&nbsp;PhD thesis is prediction of three-dimensional&nbsp;structure of&nbsp; beta-galactosidases of&nbsp; selected&nbsp;bacterial strains (<em>Streptococcus thermophillus,&nbsp;Lactobacillus acidophilus </em>and <em>Bifidobacterium&nbsp;animalis</em> ssp. <em>lactis</em>), as well as characterization&nbsp;of their active sites and active residues.&nbsp;Furthermore, this thesis include investigation&nbsp;<em>Bacteroides thetaiotaomicron</em>&nbsp; and&nbsp;<em>Kluyveromyces lactis</em> beta-galactosidases. Based&nbsp;on sequence &nbsp;similarity analyzed sequences can&nbsp;be clustered in two clusters. Members of cluster&nbsp;<br />1 belong to GH-2 subfamily, while members of&nbsp;cluster 2 belong to GH-42 subfamily. Cluster&nbsp;analysis and sequence alignment revealed&nbsp;potential active residues: GLU458/GLU546 - S.&nbsp;thermophillus,&nbsp; GLU148/GLU307&nbsp; -&nbsp; L.&nbsp;Acidophilus&nbsp; and&nbsp; GLU164/GLU324&nbsp; -&nbsp; B.&nbsp;animalis ssp. lactis.&nbsp; Homologous models of&nbsp;beta-galactosidases from&nbsp; <em>S. thermophilus,&nbsp; L.&nbsp;acidophilus,&nbsp; B. animalis&nbsp;</em> ssp.&nbsp; <em>lactis</em>&nbsp; are&nbsp;<br />constructed as a result of this PhD thesis.&nbsp;Molecular docking simulations of all beta-galactosidases revealed that substrate binds in&nbsp;region with high electronegativity. &nbsp;Furthermore,&nbsp;docking simulations confirmed active sites&nbsp;suggested by sequence alignment. As only one&nbsp;crystal structure with lactose in its active site&nbsp;has been published, docking simulations with&nbsp;lactose as a ligand were also performed with&nbsp;<br />experimentally determined beta-galactosidases&nbsp;structures. Also, lactose and &nbsp;alactose &nbsp;binding&nbsp;residues are predicted. Based on sequence&nbsp;similarity&nbsp; GLU259&nbsp; can be recognized as&nbsp;nucleophile of&nbsp;<em> B. thetaiotaomicron&nbsp;</em> beta-galactosidase. By analysis of conserved regions&nbsp;and docking simulation, GLU182 is predicted as&nbsp;a proton donor residue. Chemical composition&nbsp;of milk used for Kluyveromyces lactis&nbsp; beta-galactosidase research had appropriate quality&nbsp;according to directions of Ministry of&nbsp;<br />agriculture and environmental protection of&nbsp;Republic of Serbia. Total lactose content was&nbsp;degraded in permeate after 60 min using&nbsp;enzyme concentration of 0,1% at&nbsp; 40&deg;C.&nbsp;Maximal degradation was reached in the first 10&nbsp;min. Based on the results, it can be concluded&nbsp;that <em>Kluyveromyces lactis</em> beta-galactosidase has&nbsp;high efficiency for &nbsp;lactose degradation, which&nbsp;makes it commercially interesting for milk&nbsp;industry. Protocol for modeling of commercially&nbsp;important beta-galactosidases and their&nbsp;<br />interactions with lactose is developed as a result&nbsp;of this PhD thesis. Obtained results should&nbsp;provide the frame for molecular investigation of&nbsp;lactose binding and degradation, as well as for&nbsp;designing of commercially suitable beta-galactozidases.&nbsp;</p>